产品简介

线粒体是细胞呼吸的主要场所，细胞活动所需的能量主要由在线粒体内进行的氧化所产生的能量来供应。制备线粒体的关键是保持线粒体的完整性和纯度，可通过分级分离法获得，即先低俗出去细胞核以及细胞碎片，再进行高速梯度离心分离线粒体。

细胞线粒体分离试剂盒(Cell Mitochondria Isolation Kit)是快速便捷分离培养细胞中的线粒体的试剂盒，分离线粒体的同时可以获得去除线粒体的细胞浆蛋白，可用于分析细胞色素 C 等线粒体蛋白向胞浆的释放，大部分获得的线粒体都含有完整的内膜和外膜，并具有线粒体的生理功能(如检测线粒体膜电位)，获得的蛋白可用于 SDS-PAGE、Western、双向电泳等蛋白分析。

本试剂盒提供了蛋白酶抑制剂PMSF，使匀浆时蛋白酶的活性被适当抑制，这样在获得线粒体的同时还可以获得有时有用的去除了大量线粒体的蛋白，在进行蛋白或酶活分析时可以作为对照

该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。

试剂组分

试剂(A): Mitochondria Lysis buffer 100ml -20℃
试剂(B): Trypan Blue Stain 10ml 4℃ 避光（可选）
试剂(C): Wash buffer 100ml -20℃
试剂(D): Mitochondria Stock buffer 10ml -20℃
试剂(E): Protein Stock buffer(5×) 20ml RT
试剂(F): PMSF(100×) 1.5ml -20℃

有效期： 12 个月有效。

自备材料：1、 胰蛋白酶；2、 低温离心机、匀浆器；3、 PBS；

操作步骤 (仅供参考) ：

1、清洗：用预冷的 PBS 清洗细胞 1 次，4℃ 1000g 离心 5min，弃上清。

2、裂解：沉淀用 1～2ml 预冷的 Mitochondria Lysis buffer 重悬细胞，冰浴放置 10～15min，可用相差显微镜检测膨胀的程度。

3、匀浆：把细胞悬液转移至匀浆器中，匀浆 10～20 次。不同细胞或不同匀浆器所需的匀浆次数有所不同，需自行优化。

4、立即取匀浆液，加入等量 Wash buffer，轻轻颠倒混匀数次。

5、4℃，1300g 离心 5min 以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。

6、上清液转移至一干净离心管，4℃ 1000g 离心 5min，重复 2 次。

7、上清液转移至一干净离心管，4℃ 12000～15000g 离心 15min，重复 1 次。

8、弃上清，沉淀为线粒体，如果希望获得去除线粒体的细胞浆蛋白，应在本步骤中收集上清，并且在收集上清时注意勿触及沉淀。随后把收集的上清 12000g，4℃离心 10min，上清即为去除线粒体的细胞浆蛋白。获得的细胞浆蛋白应保存于 1×Protein Stock buffer，即按细胞浆蛋白：Protein Stock buffer (5×)=4：1比例混合；如果用于双向电泳，应使用恰当的保存液。

9、保存：弃上清，用适当缓冲液悬浮沉淀。如果用于线粒体酶活性或功能的分析，线粒体沉淀应重悬于 Mitochondria Stock buffer；如果用于双向电泳，请使用适当的用于双向电泳的裂解液处理线粒体。

注意事项

1、试剂(如台盼蓝染色液)对于不同实验不必全部使用，在实验条件成熟后可以不必使用。

2、如果不是用于制备线粒体蛋白，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer 中不必加入 PMSF。如果用于制备线粒体蛋白样品，Mitochondria Lysis buffer 和 Wash buffer中需添加 PMSF。PMSF 一定要在试剂加入到样品中前 1～2min 内加入，使PMSF的最终浓度为1mM，以免 PMSF在水溶液中很快失效。

3、分离线粒体的所有步骤均需在冰上或 4℃进行，所用溶液需冰浴或 4℃预冷，全部操作时间尽量控制在 1h 以内。

4、通常在分离线粒体时前后两次离心速度选取 1000g 和 15000g，如果希望纯度更高，但对线粒体的得率要求不高，前后两次离心速度可用 2000g 和 6000g。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。